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間接ELISA實驗的缺點是存在交叉反應的可能性(酶標二抗直接與抗原結合),可能會增加背景,同時與直接ELISA相比,間接ELISA實驗多了二抗孵育的步驟,實驗周期延長。 先將捕獲抗體固定于ELISA板孔中,然后加入樣品,接著加入檢測抗體。
競爭法ELISA一般用于檢測小分子抗原。 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點,無法同時與兩種抗體結合因此不能用雙抗體夾心法進行測定,故可以采用競爭法模式。 一般常用于小分子、lgA、lgG、lgM等檢測。
但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的,樣本中的靶蛋白及其他雜質蛋白都會與ELISA板結合,實驗背景會比較高。 而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準備能夠與其特異性結合的一抗,實驗不太靈活。